膝舒胶囊质量标准研究

[摘要]目的：建立膝舒胶囊的定性鉴别和含量测定的方法。方法：用TLC法定性鉴别膝舒胶囊中当归、独活、威灵仙；用HPLC法测定独活中蛇床子素含量。色谱条件为：迪马C18柱；流动相：乙腈一水(48：52)洗脱；检测波长330nm。结果：TLC斑点清晰，分离度好，阴性对照无干扰；蛇床子素进样量在0．0616～0．616~g范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系(r=0．9999)；平均回收率为99．83％，RSD为0．51％。结论：所建立的定性、定量分析方法可用于膝舒胶囊的质量控制。
[关键词]膝舒胶囊；质量标准；蛇床子素；当归；独活；威灵仙

膝舒胶囊由狗脊、熟地黄、独活、当归、党参、土鳖虫等九味药材组成，经提取制成的中药复方制剂，具有补肝肾，调气血，通经络，祛寒湿功效，临床用于膝关节退行性骨关节病。为有效监测该制剂的产品质量，我们用薄层色谱法对制剂中的当归、独活、威灵仙进行定性鉴别；采用高效液相色谱法测定独活中的有效成分蛇床子素的含量，所得定性、定量分析方法可客观反映本制剂的内在品质，为该品种的质量控制和评价指标提供理论依据。
1仪器与试药
LC一20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；薄层成像色谱仪(瑞土卡玛公司)；AE一240S型电子天平(梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司)；KQ一400DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)蛇床子素对照品(批号：110822—200407)，供含量测定用；当归对照药材(批号：120927—200613)、独活对照药材(批号：120940—200809)，供鉴别用，均由中国药品生物制品检定所提供；硅胶G预制薄层板(青岛海洋化工有限公司)；膝舒胶囊样品，缺当归、缺独活、缺威灵仙阴性样品(均由本院提供)；试验用乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2．1当归的薄层鉴别
取本品内容物5g，加90％乙醇50mL，超声处理40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水40mL使溶解，用乙醚提取2次，每次40mL，合并乙醚液，蒸干，残渣用乙酸乙酯1mL使
溶解，作为供试品溶液。另取缺当归阴性样品5g，同法制成缺当归阴性对照溶液。再取当归对照药材1g，加乙醚30mL，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣用乙酸乙酯lmL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液、缺当归阴性对照溶液各61xl、对照药材溶液3l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷一乙酸乙酯(4：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色渚中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。
2．2独活的薄层鉴别
取缺独活阴性样品5g，照当归供试品溶液制备方法制成缺独活阴性对照溶液。另取独活对照药材1g，加乙醚30mL，浸渍过夜，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取当归供试品溶液、缺独活阴性对照溶液、对照药材溶液各5l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷一石油醚(60～90℃)一乙酸乙酯(2：1：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。
2．3威灵仙的薄层鉴别
取本品内容物5g，加70％乙醇50mL，超声处理40分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水40mL使溶解，通过D101型大孔树脂柱(直径1cnl，柱长10cm，湿法装柱)，用水80mL洗脱，弃去水洗液，再用50％乙醇60mL洗脱，收集50％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加水40mL使溶解，用水饱和正丁醇提取3次，每次40mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2
次，每次40mL，正丁醇液蒸干，残渣用乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取缺威灵仙阴性样品5g，同法制成缺威灵仙阴性对照溶液。再取威灵仙对照药材3g，加70％乙醇50mL，回流提取1小时，滤过，蒸于，加水40mL使溶解，用乙醚提取2次，每次30mL，弃去乙醚液，挥尽乙醚，通过D101型大孔树脂柱，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各101xL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷一甲醇一甲酸(6：4：0．2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。
2．4含量测定
色谱条件：迪马c色谱柱(250mm×4．6mm，5m)；以乙腈一水(48：52)为流动相，流速为1．0mL／min，检测波长330nm，柱温30℃。理论板数按蛇床子素峰计算应不低于3000。
供试品溶液的制备：取本品内容物适量，研细，取约3g，精密称定，精密加入甲醇40mL，称定重量，超声处理(功率100W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足损失的重量，摇匀。精密量取续滤液20mL，蒸干，残渣加水25mL使溶解，用乙醚提取4次，每次30mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，移至10mL量瓶中，加甲醇至刻
度，摇匀，用0．45i~m微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。对照品溶液的制备：精密称取蛇床子素对照品3．08mg，置100mL量瓶中，加甲醇适量使溶解，并用甲醇定容至刻度，摇匀，即得0．0308mg／mL蛇床子素对照品溶液。缺独活阴性对照溶液的制备：取不含独活的阴性样品适量，照供试品溶液制备方法，得缺独活阴性对照溶液。
系统适用性试验：精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10L，测定。供试品色谱在与对照品色谱相应保留时间，有相应色谱峰，阴性对照色谱无相应色谱峰，结果表明阴性对照不干扰样品测定，目标峰与相邻色谱峰分离度均大于1．5。见图1。

线性关系考察：精密吸取对照品溶液2、4、8、12、16、201xL，注入液相色谱仪。以峰面积积分值()为纵坐标，进样量(g)为横坐标，进行线性回归，得回归方程A：3533036．38C一13199．71，r=0．9999。结果表明，蛇床子素进样量在0．0616～0．616txg范围内与峰面积线性关系良好。
精密度试验：精密吸取同一对照品溶液，重复进样5次(进样量101xL)，测定峰面积，蛇床子素峰面积相对标准偏差(RSD)为0．25％。表明仪器精密度良好。制备方法制备样品，分别于0、1、4、8、12小时注入高效液相色谱仪，测定蛇床子素峰面积，其相对标准偏差(RSD)为0．10％，表明供试品溶液至少在12小时内稳定。
重复性试验：取同一批样品，按拟定的含量测定方法，分别制备5份供试品溶液，测定蛇床子素含量，其相对标准偏差(RSD)为1．83％，表明本方法重现性良好。
加样回收率试验：取本品内容物适量，研细，精密称定5份，分别加入蛇床子素对照品溶液适量(配成溶液加入)，按拟定的含量测定方法。测定蛇床子素含量，计算回收率。蛇床子素平均回收率为99．83％，相对标准偏差(RSD)为0．51％。结果见表1。

样品含量测定：取膝舒胶囊不同批号样品，按供试品制备方法处理后测定。计算每粒胶囊中蛇床子素的含量，结果见表2。

3讨论
制剂中当归、独活、威灵仙的薄层鉴别研究，分别以对照药材为对照，经方法学考察，薄层斑点分离良好，斑点圆整清晰，阴性无干扰，同时试验三批成品，结果均能检出相应色谱斑点，表明选定的方法具有专属性和重现性，可作为膝舒胶囊制剂质量控制定性检测指标。
本品由狗脊、熟地黄、当归等组成，由于狗脊、熟地黄中专属性成分含量较微，缺乏定量依据；测定当归有效成分的含量在处方中其它药味有干扰，故我们采用HPLC方法测定本品中蛇床子素的含量。供试品溶液甲醇提取后，用乙醚萃取，杂质峰除去明显，样品溶液呈澄清状态，除杂效果显著，用此方法制备供试品简单、快速，测定结果准确，供试品溶液中目标峰与相邻色谱峰分离度大于1．5，该方法可用作本制剂质量控制的含量测定。
本试验建立鉴别当归、独活、威灵仙的TLC法，能够鉴别出当归、独活、威灵仙的特征性斑点；建立测定蛇床子素含量测定方法，精密度、稳定性、重现性符合要求。上述两种方法为制定膝舒胶囊质量标准提供了理论依据。
[参考文献]
[1]国家药典委员会编．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京：中国医药科技出版社，2010：附录34．
[2]盛国荣．退白汤中当归、黄芪、丹参、首乌、补骨脂的TLC法鉴别[J]．海峡药学，2012，24(1)：62．
[3]刘新国，周莉玲，郭丽蓉．跌打止痛巴布剂中蛇床子、独活、川芎等药味的鉴别研究[J]．中成药，2010，32(12)：2186．
[4]陈华，蔡丽云．舒筋络片薄层色谱鉴别[J]．中国药师，2008，11(4)：478